Valutazione dell’embrione: dall’analisi morfologica tradizionale ai sistemi time-lapse

         La selezione degli embrioni con un elevato grado di competenza da trasferire in utero alla paziente al momento del transfer è un requisito fondamentale per il successo delle tecniche di fecondazione assistita. Fondamentale, per tale selezione, è il ruolo dell’embriologo.

         Il sistema di valutazione della qualità embrionaria tradizionale prevede l’osservazione degli embrioni al microscopio ogni giorno e a orari prestabiliti, a partire dal giorno successivo al prelievo degli ovociti in cui si valuta l’avvenuta fecondazione fino al giorno del transfer, che si esegue generalmente in terza giornata (transfer allo stadio di clivaggio) o in quinta/sesta giornata (transfer allo stadio di blastocisti) dal prelievo ovocitario. Eventuali embrioni sovrannumerari possono essere mantenuti in osservazione fino alla sesta giornata ed essere crioconservati al fine di aumentare le probabilità cumulative di gravidanza a partire da un singolo prelievo di ovociti.

         Le indicazioni per la valutazione della morfologia embrionaria e le tempistiche di osservazione sono dettati dalla Istanbul Consensus, redatta nel 2011 dopo l’istituzione di un gruppo di lavoro costituito da embriologi internazionali con l’obiettivo di fornire delle indicazioni standardizzate per la classificazione embrionaria.

         La valutazione della fecondazione (giorno 1 post-inseminazione) avviene a circa 17 ore post-inseminazione. L’ovocita correttamente fecondato, detto zigote, è caratterizzato da due pronuclei che rappresentano il materiale genetico di origine femminile (ovocita) e di origine maschile (spermatozoo) uniti nell’atto della fecondazione, e da due globuli polari che derivano dalla divisione cellulare (meiosi) a cui va incontro l’ovocita.

         Nei giorni successivi vengono valutati il numero di cellule, dette blastomeri, che costituiscono l’embrione, il grado di frammentazione ossia la quantità di frammenti che presenta l’embrione e la presenza di multinucleazione, ossia la presenza di più di un nucleo in ogni blastomero. In base a tali caratteristiche, a ogni embrione viene assegnato un punteggio (grado 1, 2 oppure 3) che esprime la sua qualità al momento dell’osservazione e consente di prevedere la sua competenza per proseguire il suo sviluppo e quindi impiantarsi in utero. L’embrione ottimale (grado 1) in seconda giornata, circa 44 ore post-inseminazione, è costituito da 4 blastomeri di uguale dimensione mononucleati (un solo nucleo per cellula) e con frammentazione inferiore al 10%. Un embrione ottimale in terza giornata (circa 68 ore post-inseminazione) è costituito, invece, da 8 blastomeri mononucleati di uguale dimensione.

         A partire dalla quarta giornata post-inseminazione l’assetto cellulare dell’embrione cambia, e di conseguenza cambiano i parametri di valutazione della qualità embrionaria. In quarta giornata post-inseminazione si osserva un fenomeno noto come compattazione a seguito del quale i singoli blastomeri che costituiscono l’embrione non sono più distinguibili andando a formare un aggregato compatto di cellule, la morula. La classificazione embrionaria a tale stadio si basa sul grado di compattazione cellulare; la morula ottimale, detta di grado 1, è caratterizzata da una compattazione cellulare che interessa l’intero volume dell’embrione. Segue l’inizio della cavitazione della morula che porta alla formazione di una cavità contenente liquido detta blastocele; ciò porta a un aumento di volume embrionario con assottigliamento della zona pellucida, la membrana di rivestimento dell’embrione.

         Nella quinta/sesta giornata post-inseminazione l’embrione ottimale è una blastocisti espansa nella quale è possibile distinguere due distinte popolazioni cellulari: il trofectoderma, che darà origine agli annessi embrionali, e la massa cellulare interna che darà origine al feto. La classificazione della blastocisti si basa su un punteggio che tiene conto del grado di espansione del blastocele e delle caratteristiche della massa cellulare interna e trofectoderma. Una blastocisti totalmente espansa con una buona massa cellulare interna e un buon trofoblasto è classificata, secondo le linee guida, con lo score 311.

         Con il termine di “non evolutivo” si intende un embrione le cui cellule hanno arrestato il proprio sviluppo per almeno 24 ore, o in cui le cellule risultano degenerate.

         Ogni osservazione richiede che gli embrioni vengano rimossi dall’incubatore nel quale sono posti in coltura e che assicura il mantenimento di un ambiente ideale per il loro sviluppo. Ogni qual volta gli embrioni sono rimossi dall’incubatore si verificano piccole variazioni delle condizioni di coltura.

         I progressi nel campo della tecnologia e la loro applicazione dell’embriologia hanno portato allo sviluppo di incubatori time-lapse, che consentono di mantenere gli embrioni in coltura e di osservarli senza rimuoverli dall’incubatore grazie alla presenza di piccole telecamere al loro interno che raccolgono immagini in tempo reale con una frequenza molto elevata. Si ottiene quindi, per ciascun embrione in coltura, un filmato che riproduce ogni fase di sviluppo embrionale grazie al quale l’embriologo registra, oltre che le caratteristiche, anche i tempi di divisione embrionaria. Sulla base delle informazioni ottenute dalla morfologia in aggiunta ai tempi di divisione è possibile effettuare una scelta dell’embrione da trasferire non solo su base morfologica, come previsto dall’osservazione tradizionale, ma anche su base cinetica (tempi di divisione).

         I sistemi di time-lapse rappresentano sicuramente un valore aggiunto di cui si può avvalere l’embriologo nella scelta degli embrioni da trasferire, in quanto consentono di osservare in continuo tutti gli embrioni presenti in coltura non solo dal un punto di vista morfologico delle divisioni cellulari ma anche tenendo conto dei tempi in cui si verificano tali divisioni. Pur essendo dei sistemi automatizzati, richiedono, comunque, la presenza di un operatore per l’osservazione e la valutazione embrionaria offrendo il vantaggio di osservazione degli embrioni in qualsiasi momento della giornata senza rispettare precise tempistiche che stanno, invece, alla base della valutazione morfologica standard. L’osservazione degli embrioni ai tempi prestabiliti dalla Consensus e la rapidità di valutazione embrionaria minimizzando i tempi di esposizione al di fuori dell’incubatore da parte di un embriologo esperto rappresentano comunque un valido e paragonabile metodo di selezione di embrioni a elevato grado di competenza.


Bibliografia

Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology. The Istanbul Consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Hum Reprod 2011;26(6):1270-83.
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